SYBR Green I 熒光染料：SYBR Green I 能夠與雙鏈 DNA 結合，在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 幾乎沒有熒光信號；當它與雙鏈 DNA 結合后，熒光信號會顯著增強。隨著 PCR 反應中雙鏈 DNA 的不斷合成，與 SYBR Green I 結合的量也逐漸增加，熒光信號強度與 PCR 產物的數(shù)量呈正相關，通過實時監(jiān)測熒光信號強度，即可反映出目標核酸的擴增情況，從而實現(xiàn)對病毒核酸的定量分析。

TaqMan 探針：TaqMan 探針是一段與目標核酸序列互補的寡核苷酸，其 5' 端標記有報告熒光基團，3' 端標記有淬滅熒光基團。在 PCR 反應過程中，當引物延伸至探針結合位點時，Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性會將探針降解，使報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，報告熒光基團發(fā)出的熒光信號不再被淬滅，從而產生可檢測的熒光信號。熒光信號強度同樣與 PCR 產物的數(shù)量相關，以此實現(xiàn)對目標核酸的定量檢測。

樣本采集：根據(jù)實驗目的和樣本類型，采用合適的方法進行樣本采集。如采集血清或血漿樣本時，需嚴格按照無菌操作規(guī)范進行靜脈采血，分離血清或血漿；采集組織樣本時，使用無菌器械獲取組織，并迅速放入液氮或 - 80℃冰箱中保存，避免樣本降解。

樣本處理：對于不同類型的樣本，需要進行相應的核酸提取處理。可使用 Qiagen 或其他品牌的核酸提取試劑盒，按照說明書的操作步驟提取病毒核酸。提取后的核酸樣本需進行濃度和純度測定，可采用超微量紫外分光光度計或熒光定量法進行檢測，確保核酸質量符合實驗要求。

配制反應體系：在無菌的 PCR 管中，按照以下比例配制反轉錄反應體系（以 20 μL 體系為例）：

5×QuantiTect Reverse Transcription Buffer：4 μL

QuantiTect Reverse Transcriptase Mix：1 μL

RNase - free Water：補至 14 μL

模板 RNA：適量（根據(jù)樣本核酸濃度調整，一般為 1 - 10 μL）

混合均勻：用移液器輕輕吹打或振蕩 PCR 管，使反應體系充分混合均勻，短暫離心（2000 - 3000 rpm，1 - 2 分鐘），使反應液集中于管底。

反應條件：將 PCR 管放入 PCR 儀中，設置反轉錄反應條件：42℃孵育 30 分鐘（進行反轉錄反應），95℃孵育 15 分鐘（滅活反轉錄酶）。反應結束后，將 cDNA 產物置于冰上或 - 20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

配制反應體系：在無菌的 PCR 管或反應板孔中，按照以下比例配制 PCR 反應體系（以 20 μL 體系為例）：

2×QuantiTect PCR Master Mix：10 μL

ROX Reference Dye（根據(jù) PCR 儀型號選擇合適濃度）：1 μL

上游引物（10 μM）：0.5 μL

下游引物（10 μM）：0.5 μL

cDNA 模板或 DNA 模板：適量（根據(jù)反轉錄產物或樣本核酸濃度調整，一般為 1 - 5 μL）

RNase - free Water：補至 20 μL

混合均勻：用移液器輕輕吹打或振蕩反應管或反應板，使反應體系充分混合均勻，短暫離心（2000 - 3000 rpm，1 - 2 分鐘），使反應液集中于管底。

封板：如果使用反應板，需使用封板膜將反應板密封，確保密封良好，防止反應過程中液體蒸發(fā)。

反應條件：將反應管或反應板放入實時熒光定量 PCR 儀中，設置 PCR 反應條件：

預變性：95℃，15 分鐘（激活熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶，使模板 DNA 變性）

循環(huán)反應：94℃，15 秒（變性）；55 - 60℃，30 秒（退火，根據(jù)引物的 Tm 值調整）；72℃，30 秒（延伸），進行 40 - 45 個循環(huán)

熔解曲線分析（可選，用于檢測 PCR 產物的特異性）：95℃，15 秒；60℃，1 分鐘；95℃，15 秒

啟動反應：確認 PCR 儀的參數(shù)設置無誤后，啟動 PCR 反應。在反應過程中，實時熒光定量 PCR 儀會實時監(jiān)測熒光信號強度，并記錄數(shù)據(jù)。

標準曲線法：使用已知濃度的病毒核酸標準品（如試劑盒提供的陽性對照或自行制備的標準品），進行梯度稀釋后，按照上述實驗操作步驟進行 PCR 反應，繪制標準曲線（Ct 值與標準品濃度的對數(shù)呈線性關系）。根據(jù)樣本的 Ct 值，在標準曲線上查找對應的核酸濃度，從而實現(xiàn)對樣本中病毒核酸的定量分析。

相對定量法：如果只需要比較不同樣本之間病毒核酸的相對表達量，可采用相對定量法。選擇一個內參基因（如 β - actin、GAPDH 等），同時對樣本中的內參基因和目標病毒核酸進行 PCR 反應，通過計算目標基因與內參基因的 Ct 值差值（ΔCt），以及不同樣本之間的 ΔΔCt 值，來分析目標病毒核酸在不同樣本中的相對表達變化。

嚴格按照說明書要求的儲存條件保存試劑，避免試劑因儲存不當而失效。

使用前將試劑從冰箱中取出，置于室溫下解凍，并充分混勻，但要避免劇烈振蕩，防止產生氣泡。

試劑使用過程中，應使用無菌的移液器和吸頭，避免交叉污染。每次取試劑后，及時將試劑管蓋緊，放回冰箱保存。

樣本采集和處理過程中，需嚴格遵守無菌操作規(guī)范，防止樣本被外源核酸污染，導致假陽性結果。

對于高致病性病毒樣本，需在生物安全實驗室中按照相應的生物安全等級進行操作，確保操作人員的安全。

樣本核酸提取過程中，要注意操作的準確性和穩(wěn)定性，確保提取的核酸質量符合實驗要求。提取后的核酸樣本應盡快進行檢測，如需保存，可置于 - 80℃冰箱中，但避免多次凍融。

實時熒光定量 PCR 儀需定期進行校準和維護，確保儀器的性能穩(wěn)定和檢測結果的準確性。

在使用 PCR 儀前，檢查儀器的運行狀態(tài)，確保儀器的溫度、熒光檢測等功能正常。

反應板和封板膜需與 PCR 儀兼容，封板時要確保密封良好，防止反應過程中液體蒸發(fā)和污染。

在進行實驗前，需合理設計實驗方案，設置足夠的重復樣本和對照樣本（如陽性對照、陰性對照、空白對照等），以確保實驗結果的可靠性和可重復性。

對于不同類型的病毒和樣本，需根據(jù)其特點和實驗需求，選擇合適的引物和探針，并進行預實驗，優(yōu)化實驗條件。

原因：可能是引物或探針設計不合理、引物或探針濃度過低、模板核酸質量不佳、反應體系中存在抑制劑、PCR 反應條件不合適等。

解決方法：重新設計引物或探針，確保其特異性和有效性；適當提高引物或探針的濃度；重新提取樣本核酸，確保核酸質量；檢查反應體系中是否存在抑制劑，如樣本中可能含有蛋白質、多糖等物質，可通過純化核酸或稀釋樣本進行處理；優(yōu)化 PCR 反應條件，如調整退火溫度、延伸時間等。

原因：可能是模板核酸濃度過高或過低、引物或探針濃度不合適、dNTPs 濃度不足、熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶活性下降、PCR 反應循環(huán)數(shù)設置不合理等。

解決方法：對模板核酸進行梯度稀釋，選擇合適的濃度進行實驗；調整引物或探針濃度；檢查 dNTPs 濃度，確保其充足；更換熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶；根據(jù)實驗需求，合理調整 PCR 反應循環(huán)數(shù)。

原因：可能是模板核酸濃度過低、引物或探針效率低、PCR 反應條件不合適、反應體系中存在抑制劑等。

解決方法：增加模板核酸的上樣量；優(yōu)化引物或探針設計，提高其擴增效率；調整 PCR 反應條件，如提高退火溫度、延長延伸時間等；對樣本進行純化處理，去除抑制劑。

原因：可能是實驗過程中發(fā)生交叉污染、引物或探針特異性差、陽性對照濃度過高、PCR 反應條件過于寬松等。

解決方法：加強實驗操作的規(guī)范性，使用帶濾芯的吸頭，避免交叉污染；重新設計引物或探針，提高其特異性；降低陽性對照的濃度；優(yōu)化 PCR 反應條件，提高反應的嚴謹性。

原因：可能是引物二聚體形成、非特異性擴增、模板核酸不純等。

解決方法：降低引物濃度，優(yōu)化引物設計，減少引物二聚體的形成；調整 PCR 反應條件，提高反應的特異性；對模板核酸進行進一步純化處理，去除雜質。